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蓝莓组培技术介绍
一、实验室设计
1.洗涤室: 器具的洗涤、干燥
2.配置室: 进行药品的保存、配置、消毒、分装等。
3.灭菌室: 对培养进行高温高压灭菌,有时候也会把培养基的熬制、分装放在此房间。
4.接种室:进行材料的接种,内置超净工作台或接种箱。外设缓冲间-放置拖鞋、工作服、工作帽等。
5.培养室:植物材料的无菌培养,室内主要有培养架和控制温度及光照的设备。
其他配套:大型组培室,包括工厂化组培车间还好专门配套仓库、更衣室和办公室等,有的还要配备细胞学观察实验室,进行培养材料的组织学、细胞学、观察照相等。
二、常用设备和器材
1.高压蒸气灭菌锅:用于培养基、蒸馏水和接种器械的灭菌消毒。
2.超菌工作台:用于培养物的无菌操作。(由鼓风机、滤板、操作台、紫外灯和照明灯组成)
3.接种工具:包括镊子、剪刀、解剖刀、洒精灯、接种器械灭菌器等。
4.培养设备:包括空调机、定时器、温度控制器、增湿机或去湿机、培养架、光照培养箱等。
5.配置设备:包括天平、酸度计、磁力搅拌器、蒸馏水器、烘箱或玻璃仪器烘干器、电炉、药品柜、冰箱或冷柜、晾瓶架等。
在这些仪器设备中,高压灭菌锅、超净工作台、电子天秤、培养架、冰箱、接种工具等是组培必备的,也是每天都要用到的,因此质量要可靠。
三、玻璃器皿的选择和清洗
1.玻璃器皿的选择
*试管- 适合于用少量培养基及试验各种不同配方时选用。
*三角锥瓶- 适用于各种培养(如固体培养、液体培养、大规模培养或一般培养)。
*L形管和T形管- 为专用的旋转式液体培养试管。
*培养皿- 适于作单细胞的固体平板培养、胚和花药培养和无菌发芽。
*角形培养瓶和圆形培养瓶- 适用于液体培养用,如单细胞和原生质体的浅层培养。
*组培瓶/果酱瓶- 常用作试管苗大量繁殖用的培养瓶。
组培产业网(http://www.51zupei.com/)
2.玻璃器皿的清洗
(1)清洗玻璃器皿用的洗涤剂有肥皂、洗洁精、洗衣粉、和铬酸钾洗涤液。
(2)清洗时先将器皿中的残渣除去,用清水洗净,再用热的肥皂水或洗洁精洗净,清水冲洗干净后用蒸馏水冲洗一次,干后备用。
(3)洗净的玻璃器皿应透明发亮、内外壁水膜均匀,不挂水珠。
四、影响蓝莓组培的因素
1.树种因素:(1)基因型,(2)植株年龄,(3)组织和器官的年龄,(4) 植株的生理状态,(5)取材年份及生长条件,(6)取材部位及大小。
2.培养基因素:无机盐、有机化合物、植物激素、天然提取物、琼脂、PH值、渗透压、活性炭。 蓝莓组织培养的成功与否,除了培养材料本身的因素外,很大程度上取决于对培养基的选择。培养基的种类、成份等直接影响培养材料的生长发育。故应根据培养材料的种类和部位,选取适宜的培养基。
3.外植体的选择和灭菌:不同品种、不同器官之间的分化能力有差别,且组织培养是建立在无菌操作基础之上的专门技术,因此在进行蓝莓组织培养时,必须选择合适的外植体进行灭菌操作,以确保组织培养工作的顺利进行。
4.环境因素:(1)光照:包括光强、光质、光周期,(2)温度,(3)湿度,(4)气体。
五、蓝莓培养基的主要成分
(一)、基本培养基的主要成分:
1.无机盐:(1)大量元素:C.H.O.N.P.K.Ca.Mg.S.Cl。(2)微量元素:Fe.Cu.Mo.Zn.Mn.Co.B.Na。(3)水:培养基95%是水,应使用蒸馏水、双蒸水或使用去离子水,水应放在塑料容器中。
2.有机化合物:(1)糖(碳源和能源),(2)维生素类:有维生素b1(盐酸硫胺素)、维生素b6(盐酸砒哆醇)、生物素、烟酸、叶酸等,(3)氨基酸类(有机氮源)。
3.植物激素(生长调节物质):
(1)生长素:主要包括IAA(吲哚乙酸)、NAA(萘乙酸)、2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、IBA(吲哚丁酸);它们的主要作用是诱导愈伤组织的形成、胚状体的产生以及试管苗的生根,更重要的是配合一定比例的细胞分裂素诱导腋芽及不定芽的产生;作用的强弱顺序为:2,4-D>NAA>IBA>IAA。
(2)细胞分裂素:天然:6-BA(6-苄基酰嘌呤)、KT(激动素,糠基酰嘌呤);人工:ZT(玉米素)、2-iP(2-异戊烯酰嘌呤);它们的主要作用是促进细胞的分裂和器官的分化、延缓组织的衰老、增强蛋白质的合成、抑制顶端优势、促进侧芽的生长及显著改变其他的激素作用;作用的强弱顺序为:TDZ,4PU>ZT>2-iP>6-BA>KT。
(3)赤霉素:GA3。
(4)乙烯及乙烯抑制剂。
4.天然提取物(如椰乳、酵母提取物、番茄汁、香蕉泥等),其作用是提供一些必要的微量营养成分、生理活性物质和生长激素等。
5.琼脂(是从海藻中提取的一种高分子碳水化合物),其主要作用是使培养基在常温下凝固,同时不参与代谢。
6.活性炭:加入培养基中的目的主要是利用其吸附能力,减少一些有害物质的影响,如可以防止酚类物质污染而引起组织褐化死亡。
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(二)、蓝莓培养基:上面提到这些物质是组培过程经常用到,具体到蓝莓,一般用WPM培养基作为基本培养基,激素多用KT、6-BA,天然提取物和活性炭一般不用。
六、蓝莓外植体的选择和灭菌
(一)、外植体的选择:以春季初发的嫩梢最为合适,取材时间要在晴天下午取材,取材部位以靠近木本的下部内堂枝为好。
(二)、外植体的灭菌方法
1、常用灭菌药剂的使用和效果:
消毒剂 使用浓度/% 清除难易 消毒时间/min 灭菌效果
次氯酸钠 2 易 5-30 很好
次氯酸钙 9-10 易 5-30 很好
漂白粉 饱和溶液 易 5-30 很好
升汞 0.1-1 较难 2-10 最好
酒精 70-75 易 0.2-2 好
过氧化氢 10-12 最易 5-15 好
溴水 1-2 易 2-10 很好
硝酸银 1 较难 5-30 好
抗菌素 4-50mg/L 中 30-60 较好
对于蓝莓而言,一般先用75%酒精处理10-30苗,再用升汞处理5-10分钟,根据材料的老嫩程度、外界环境不同而选择适当的处理时间,一般是从低到高作实验摸索最佳的处理时间。
2.灭菌方法:
(1)茎尖、茎段及叶片等的消毒:用清洁剂清洗、水流冲刷4小时左右---75%酒精浸泡10-30秒---无菌水洗1-2次---升汞溶液泡5-10min---无菌水洗7-10次
七、外植体接种和培养
1.外植体的接种
(1)接种室的消毒:用70%酒精喷雾使细菌和真菌孢子随灰尘的沉降而沉降,再用紫外灯照射20min;并且每月用高锰酸钾与甲醛蒸气熏蒸一次。超净工作台可用新吉尔灭或酒精擦洗,其它一切器皿、衣物都要经严格的灭菌才能带进接种室。
(2)接种:左手拿培养瓶,右手拿接种工具接种,瓶口要靠近酒精灯火焰、接种动作要快,以免造成污染。
2.培养方法
(1)根据外植体不同可分为:胚胎培养、器官培养、组织培养、细胞培养、原生质体培养。蓝莓常用的是器官培养或组织培养。
(2)根据培养方式不同可分为: 固体培养、液体培养、半固体培养、双层培养。具体到蓝莓,一般都是固体培养,即用琼脂作为支持物,在固体培养基上培养蓝莓组培苗。
3.培养条件:指温度、湿度、光照、PH值、氧和其它气体等。蓝莓一般在25度左右进行光照培养,光强一般为3000-5000Lux,培养间湿度不宜过高,要控制是60%以下。经过三十多天的培养,就可进行分苗了。
八、组培苗生根和驯化
增值的蓝莓苗达到所需的规模后,即可进行生根处理了。蓝莓一般采取瓶外生根技术,即在温室内进行扦插生根,此种方法可以大量节省组培室的投资规模和生产成本
 
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